Pearl Mackie interessierte sich bereits als Kind für die Schauspielerei. Allerdings sah sie ihre gemischtrassige Herkunft - die Familie ihres Vaters stammte aus Westindien, während ihre Mutter angelsächsischer Abstammung war - als Hindernis an. Im Alter von zehn Jahren wurde sie für die Rolle der Nancy in einer Schulproduktion von „Oliver!“ gecastet, nachdem ihre Mutter sie zu einer Vorführung des Stückes im West End mitnahm. Dort wurde die Rolle der Nancy von Sonia Swaby dargestellt, die jamaikanischer und englischer Abstammung war; Mackie war erstaunt, als sie erkannte, dass ihr Traum, eine professionelle Schauspielerin zu werden, wahr werden könnte. Während ihrer Teenagerjahre suchte sie weiterhin nach Bühnenrollen und förderte gleichzeitig ihre Gesangs- und Tanzfähigkeiten. Mackie schloss ihr Schauspielstudium an der University of Bristol ab, gefolgt von zwei Jahren an der Bristol Old Vic Theatre School, die sie 2010 abschloss.
Mackie konzentrierte sich mehrere Jahre lang auf Bühnenrollen und arbeitete gleichzeitig als Backgroundsänger für Freddie and the Hoares. Ihr Filmdebüt gab sie 2013 in „Svengali“, während ihr erster Fernsehauftritt 2014 eine Episode von „Doctors“ war. Allerdings zeichnete sich eine viel größere Rolle ab: 2016 wurde Mackie als Bill Potts in Doctor Who gecastet. Sie war zunächst in einer Minifolge mit dem Titel „Friend From The Future“ zu sehen, die zur Halbzeit eines FA-Cup-Halbfinalspiels im April ausgestrahlt wurde. Bill war nicht nur eine Abkehr von der jüngsten Reihe weißer Begleiterinnen wie Clara, Amy und Donna, sondern sie war auch die erste explizit lesbische Begleiterin; Mackie selbst machte später ihre Bisexualität öffentlich. Bill begleitete Peter Capaldis zwölften Doctor bis zum Staffelfinale, The Doctor Falls. Mackie wurde jedoch schnell für Capaldis Abgang im Weihnachtsspecial 2017 „Twice Upon A Time“, zurückgeholt.